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水解蛇蜕的几种要领及水解产品的生物活性切磋

发布时间:2019-01-24 04:07:00 文章来源:四川航空    

蒋凯 严成长 丁秦超 陈鑫珉 梁文星 丁滨

摘 要:目的 比力几种蛇蜕水解要领的水解效果,并以HaCaT细胞评价水解产品的生物活性。要领 行使乙酸、NaOH、氧化还原两步法在各异温度和时间前提下水解蛇蜕;行使茚三酮法、考马斯亮蓝法检测水解产品中氨基酸及多肽的含量;用HPLC测定提水解产品分子量;行使HaCaT评价水解产品的生物活性。了局 酸水解的最适前提为80℃、2.5mol/L乙酸反响6h;碱水解的最适前提为80℃、0.625mol/L NaOH反响6h;氧化还原水解法最适试剂浓度离别为6%过硫酸氢钾、4mol/L尿素、1.25%亚硫酸氢钠;议决上述要领得到的胶原卵白多肽分子量约为1kDa。该多肽可以促进细胞体外增殖。

关头词:蛇蜕;多肽;水解;生物活性

中图分类号:R932 文献标志码:A 文章编号:2095-2945(2018)29-0032-03

Abstract: Objective: The hydrolytic efficiency of several snake slough hydrolysis methods was contrastively studied, and bioactivity of the hydrolysate was evaluated with HaCaT. Methods: The snake slough was hydrolyzed by acetic acid, NaOH and two-step redox methods at different temperatures and time. The contents of amino acids and peptides in the hydrolysates were determined by ninhydrin and coomassie brilliant blue methods, respectively. The molecular weight of hydrolyzed products was determined by HPLC. The HaCaT was used to evaluate the biological activity of the hydrolysate. Results: The optimal conditions of acidic or alkalic hydrolysis methods were as follows: 2.5 mol/L acetic acid at 80°C for 6 h, 0. 625 mol/L NaOH at 80°C for 6 h. And the optimum reagents for redox hydrolysis was 6% potassium persulfate, 4 mol/L urea assemble 1.25% sodium bisulfite. The molecular mass of the hydrolysate was about 1 kDa. The hydrolysate could promote the cell proliferation in vitro.

Keywords: snake slough; polypeptide; hydrolysis; biological activity

蛇蜕[1]是游蛇科动物的枯燥表皮膜,有龙子衣、蛇符、龙衣之称。性咸、甘、平,入肝、脾经,具有祛风、解毒、定惊、退翳的功能,富含无机盐、氨基酸、胶原卵白等成分,可议决水解得到。胶原卵白因其较好的物理本能和生物学特征,普遍用于医疗器械、食物增加、化妆品出产等范畴[2-4]。今朝国表里学者就胶原卵白生物质料的构建已开展了大量事情[5-6],个中首要集结在哺乳动物和水生动物起原的胶原卵白上,而爬虫类起原的胶原卵白开辟切磋尚不完善。本切磋比力了几种各异水解蛇蜕的要领,并初步判别水解产品的分子量巨细,验证了水解产品的生物活性。为蛇蜕水解产品的开辟和应用供给了尝试要领。

1 质料与要领

1.1 质料

本尝试中的化学及生化试剂均购自华东医药(上海)有限公司。蛇蜕颠末浙江中医药大学丁志山传授鉴定离别为中华眼镜蛇(Naja atra)尖吻蝮蛇(Deinagkistrodon acutus)和大王蛇(Elaphe carinata)。

1.2 要领

1.2.1 蛇蜕氨基酸构成的对照剖析。取1g蛇蜕粉,用10mL 6mol/L盐酸经N2除氧密封后置于110℃油浴中水解24h,獲得的水解产品用德国Sykam全主动氨基酸剖析仪剖析。

1.2.2 蛇蜕水解。碱、酸水解:取蛇蜕按质量体积比1:100离别参加各异浓度的NaOH溶液或冰醋酸溶液于4℃、40℃、80℃水浴中水解4天、24h和6h中止水解。以上水解产品置于扣留分子量为1000的透析袋中浸泡在pH7的PBS溶液,至样品pH近中性。氧化还原提取:称取洗净枯燥的蛇蜕浸没在必然浓度的过氧化氢钾溶液中,30℃恒温水浴加热60min后用蒸馏水洗净,并浸没于4%尿素、1% SDS、1.25%亚硫酸氢钠夹杂液,40℃恒温水浴加热4h,高速离心5min,取上清并调度pH至中性,-20℃冷藏。

1.2.3 氨基酸和卵白质含量的测定。选取茚三酮分光光度计法测定氨基酸含量,考马斯亮蓝法测定卵白含量。

1.2.4 HPLC剖析水解产品。离别以乳球卵白(35kDa)、肌红卵白(16.9kDa)、核糖核酸酶A(13.7kDa)、尿苷

(244kDa)等11种卵白质为尺度品。用Phenomenex供给,型号 BioSep-SEC-s2000,规格300×7.80mm的柱子,以100mmol/L磷酸盐缓冲液为起伏相,流速1.0mL/min剖析。并以分子量对数为y轴,出峰时间为x轴,制作卵白分子量尺度曲线。以上述前提同时剖析蛇蜕水解样本。

1.2.5 細胞活性尝试。用各异浓度的蛇蜕水解物水溶液在37℃包被细胞造就板2h,弃去上清液后,用心理盐水润洗两次。将105个/mL HaCaT细胞转接入已包被好的造就板内,24小时之后计数各组细胞数,用试剂盒检测造就液中乳酸脱氢酶(LDH)活性。

2 了局

2.1 蛇蜕中多见氨基酸构成

对照三种蛇蜕中多见氨基酸的含量,发现仅组氨酸含量存在差别,个中尖吻蝮蛇蛇蜕中组氨酸含量最崇高高贵过1%,中华眼镜蛇含量最低仅为0.662%。

2.2 酸解、碱解效果比对尝试

蛇蜕体积大、质量轻,在本切磋中选取1:100质量体积比,离别用各异乙酸、NaOH在各异温度下水解各异时间。水解告终后对照剖析各异前提水解产品中氨基酸(表1)和卵白质(图1)的含量。

2.3 氧化还原水解效果对照尝试

离别用1%、2%、4%、6%和8%的过硫酸氢钾溶液水解蛇蜕60min后的残渣用蒸馏水洗净,再用1M尿素和1.25M亚硫酸氢钠夹杂液继续水解,称重谋略水解效果离别为50.2±2.82%、53.8±2.33%、71.7±2.64%、86.9±0.71%和53.8±1.23%。以水解产品中的卵白质含量谋略得水解效果离别为0.42±0.019、0.45±0.017、0.57±0.011、0.73±0.009、0.44±0.012g/g蛇蜕。

2.4 水解产品分子量

HPLC剖析11种已知分子量的卵白尺度品,不异前提下剖析2.5M乙酸(图2A)和氧化还原二步法(图2B)处置的蛇蜕水解物。HPLC剖析显示,酸水解和氧化还原二步法水解获得的多肽保持时间为11.70min,凭据校准曲线判别该多肽分子量为1kDa。

2.5 蛇蜕水解产品对细胞增殖的影响

蛇蜕水解液包被的96孔板造就的HaCaT细胞,测得各组细胞造就液中LDH活性物无较着改变。细胞计数发现,8、1.6μg/mL蛇蜕溶液能促进该细胞的割裂增殖(图3)。

3 告终语

本尝试对照酸、碱、氧化还原二步法水解蛇蜕;氧化还原法的提取效果最高,酸解蛇蜕的效果高于碱水解,水解后产品为分子量月1kDa的小肽。本尝试比力各异浓度和温度下的酸解效率,证实温度、浓度均对酸解效率有很大的影响。这一了局与林琳[7]、许庆陵[8]等人的切磋了局相似,而碱水解似乎更多的受温度影响。此外,本切磋中还优化了氧化还原法水解蛇蜕中过硫酸钾的浓度。

今朝,胶原卵白在许多范畴都有严重的作用,如能够议决打针加强动物体内体外成骨的作用[9],促进鼠坐骨神经的再生[10],嵌入软骨细胞的胶原卵白凝胶能够修复软骨的缺陷[11],在体外胶原卵白可以促进上皮、内皮和角膜细胞的增殖[12]。本切磋中得到的蛇蜕多肽也有促进细胞增殖的生物活性。信任陪同着科学技艺的成长,胶原卵白的生物学功能将进一步被开辟行使,胶原卵白的提取工艺也将会不息的优化和行使。

参考文献:

[1]崔丽娜,牛晓辉,宗颖.中药蛇蜕的应用轮廓与中医药慢病防治[A].全国中医药博士生立异成长学术论坛[C].2011.

[2]董金辉.普外科国产胶原卵白缝线的应用效率切磋[J].中国医疗器械信息,2017,23(14):26-27.

[3]陈金明,冯洁,温升南.胶原卵白在食物中的应用及成长趋向[A].中国国际食物增加剂和配料博览会学术论文集[C].2010.

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[5]张孟雨.基于牛胶原卵白复合支架的组织工程人前板层半角膜的体外构建及其鉴定切磋[D].中国海洋大学,2015.

[6]李杰.鱼源胶原卵白的制备、本能剖析及其自集合构建生物质料的切磋[D].青岛科技大学,2017.

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[11]Wakitani S, Goto T, Young R G, et al. Repair of large full-thickness articular cartilage defects with allograft articular chondrocytes embedded in a collagen gel[J]. Tissue Engineering Part A, 1998,4(4):429-444.

[12]Orwin E J, Hubel A. In vitro culture characteristics of corneal epithelial, endothelial, and keratocyte cells in a native collagen matrix[J]. Tissue Engineering, 2000,6(4):307.

科技立异与应用 2018年29期

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