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HPLC—DAD—ELSD指纹图谱的化学模式识别用于黄芪质量评价

发布时间:2017-12-07 09:27:00 文章来源:未来智讯    
    [关键词]黄芪;指纹图谱;HPLC-DAD-ELSD;化学模式识别
    黄芪为豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus(Fisch.) Bge var. mongholicus(Bge.) Hsiao 或膜荚黄芪A. membranaceus(Fisch.) Bge.的干燥根[1]。市场上黄芪用药量大,但市售黄芪药材质量良莠不齐,严重影响饮片及制剂的临床疗效。黄芪中的化学成分主要有黄酮类、皂苷类和多糖等,都具有比较明显的药理作用[2-4]。为了更加科学地控制黄芪药材的质量,建立黄芪药材多成分综合评价体系是非常必要的,而指纹图谱是评价中药的有效手段之一。中药指纹图谱具有整体性和模糊性,而且相当复杂,如果单用人工分析方法不仅费时费力,而且也受到一定的主观因素影响;此外,宏量色谱数据的处理用直观的方法几乎是不可能的,而化学计量学的飞速发展,为人们评价不同的复杂系统提供了很多有效方法[5-6]。目前对黄芪的指纹图谱研究主要是指纹图谱方法的建立[7-9],缺少对黄芪指纹图谱整体性和模糊性的合理评价研究。本研究通过建立黄芪药材HPLC-DAD-ELSD指纹图谱,依据8个特征参数,运用模式识别技术如聚类分析和主成分分析法,对18个不同来源的黄芪指纹图谱的8个多维多息特征参数进行数据挖掘,旨在对黄芪指纹图谱整体性和模糊性的合理定量评价提供理论参考和实践探索。
    1材料
    Agilent 1100 Series 高效液相色谱仪,配置高压二元梯度泵、自动进样系统、柱温箱、在线真空脱气机、DAD检测器及化学工作站;Alltech-ELSD 2000检测器;Satorius电子分析天平。
    乙腈为色谱纯,水为超纯水,其他试剂均为分析纯。黄芪样品1-13来源于GAP试验基地并经广州中一药业有限公司陈伟波工程师鉴定为蒙古黄芪的干燥根;样品14,15购自市场,疑似伪品,基原未知;样品16-18经陈伟波工程师鉴定为膜荚黄芪药材。
    2方法与结果
    2.1色谱条件
    Agilent Zorbax ODS C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流动相0.2%甲酸溶液(A)-乙腈(B),梯度洗脱,0~15 min,10%~25%B,15~20 min,25%B,20~35 min,25%~32%B,35~40 min,32%~45%B,40~50 min,45%B,50~65 min,45%~65%B,65~75 min,65%~85%B,流速0.8 mL· min-1; 柱温25 ℃;进样量10 μL;检测波长280 nm。ELSD汽化室温度110 ℃,氮气流速3.0 L· min-1。
    2.2供试品溶液的制备
    黄芪药材粉碎,过40目筛。精密称量粉末2.0 g到圆底烧瓶中,加甲醇50 mL,回流提取2 h。过滤,滤液蒸干,残渣用甲醇转移到10 mL量瓶中,甲醇定容,摇匀。过0.45 μm孔径滤膜。
    2.3方法学考察
    2.3.1精密度试验 取同一供试品溶液,连续进样5次,其主要共有峰相对保留时间的RSD均小于2.0%,相对峰面积RSD均小于3.0%,表明仪器精密度良好。
    2.3.2稳定性试验 取同一供试品溶液,分别于0,2,4,8,24 h检测,其相对保留时间稳定,主要共有峰相对保留时间、相对峰面积的RSD均小于3.0%。结果表明供试品溶液在24 h内基本稳定。
    2.3.3重复性试验 取同一批号药材,按2.2项下方法分别制备供试品溶液5份,进行检测,考察方法的重复性。结果表明,主要共有峰相对保留时间的RSD均小于2.0%,相对峰面积RSD均小于3.0%,方法的重复性良好。
    2.4指纹图谱的建立
    2.4.1指纹图谱的采集 按照2.2项下方法制备18个供试品溶液,分别进样,建立黄芪药材的HPLC-DAD-ELSD色谱指纹图谱,见图1。
    2.4.2共有特征峰的标定 在黄芪药材的UV及ELSD指纹图谱上共选择了8个共有峰为黄芪药材指纹图谱的特征峰,这8个特征峰的峰面积相对比较大,以此8个特征峰的峰面积作为黄芪药材质量评价的变量指标,见图1。
    2.4.3相似度的计算 采用国家药典委员会编制的《中药色谱指纹图谱相似度评价软件》2004A版,计算18个样品指纹图谱的相似度,结果见表1。18个样品的指纹图谱及其共有模式的色谱图见图2,3。结果显示,GAP基地的黄芪药材表现出较高的一致性,而市售的14,15号样品仅有个别色谱峰与共有指纹峰保留时间一致,蒙古黄芪与膜荚黄芪的色谱峰也存在一定的差异。
         2.5化学模式识别分析
    2.5.1聚类分析 聚类分析是挖掘数据的工具之一,能获得数据的分布状况,观察每簇数据的特征,集中对特定的集合做进一步的分析。
    以8个共有峰的峰面积作为变量,运用SPSS 13.0软件对18个样品进行系统聚类分析,结果见图4。18个样品被分为3大类,其中14,15这2个市售样品被单独分为一类,16~18这3个膜荚黄芪药材被分为一类,其余基地的蒙古黄芪药材被分为一大类。结果表明,聚类分析可以对不同来源的黄芪样品进行分类评价,其结果与相似度评价结果一致。
    2.5.2主成分分析 以8个共有峰的峰面积作为变量,运用SPSS 13.0软件对18个样品进行主成分分析。主成分1与主成分2的得分图见图5,18个样品分别聚成3大类,分别是第1类的基地蒙古黄芪药材(1~13),第2类的市售样品(14,15)及第3类的膜荚黄芪药材(16~18)。主成分分析的结果与前面聚类分析及相似度评价的结果是一致的,都表明这3类样品在质量上存在一定的差异。
    主成分分析不仅能对不同来源的黄芪样品进行分门别类的区分,还能解释黄芪样品被分类的原因,即解释和评价黄芪药材指纹图谱中所蕴含的药效成分信息,获取这些数据背后潜在有用的信息来合理评价黄芪药材指纹图谱的整体特征。因子分析图见图6,主成分1主要解释了特征峰3与5的信息,即在图5中,沿着主成分1轴的方向,样品中特征峰3与5的峰面积越来越大。因此,第3类样品与第1及第2类分开的原因是第3类样品中特征峰3,5的峰面积都最低。同样,主成分2主要解释了特征峰4,7,8与特征峰1,6的信息,但两者方向相反,即在图5中,沿着主成分2纵轴的方向,特征峰4,7,8的峰面积越来越大,而特征峰1,6的峰面积变化方向正好相反。因此,第1类样品与第2类分开是因为特征峰4,7,8与特征峰1,6的峰面积存在差异,第1类样品中特征峰4,7,8的峰面积相对较高,而特征峰1,6的峰面积较低,第2类样品正好与第1类相反。
    主成分分析还可以鉴别特异与未知的样品。如样品3与样品18,分别处在主成分分析图的最上端与下最端。样品3处在最上端与第1类的其他样品距离较远的原因是,样品3中特征峰8的峰面积最大,而样品18是由于其特征峰1,6的峰面积最大。还有第2类的市售样品,在通过性状无法鉴定其真伪时,可以借助本方法很容易将其与正品药材区别开来,在临床应用时应注意。
    3讨论
    对超声、回流、索氏3种提取方法和不同的提取溶剂甲醇、50%甲醇、75%甲醇以及不同的提取时间进行了考察,通过比较发现本试验确定的样品制备方法可以同时有效提取黄芪药材中皂苷类及黄酮类成分。
    市场上黄芪的来源主要是蒙古黄芪,本试验收集到的膜荚黄芪样本较少。通过相似度评价,蒙古黄芪与膜荚黄芪的指纹图谱在整体上基本相似,但也存在一定的差异,而通过主成分分析发现,两者的差异主要是体现在某些成分的含量差异较大。建议今后收集大量的样品进行更深入的比较研究。
    通过建立黄芪药材的HPLC-DAD-ELSD指纹图谱,并运用化学模式识别技术如聚类分析和主成分分析,对黄芪指纹图谱进行模式识别,能有效直观地对不同来源的黄芪药材进行鉴别和质量评价,特别是主成分分析,能深度挖掘中药指纹图谱所蕴含的药效成分信息,从而获取这些数据背后潜在有用的信息来合理评价中药指纹图谱的整体特征。
    黄芪市场用量大,产地分布广,气候差异较大,对黄芪的质量会造成一定的差异,为了保证临床用药的疗效和中药制剂的质量稳定,应建立黄芪GAP基地,运用指纹图谱结合化学模式识别技术,严格控制黄芪药材的质量稳定。
    [参考文献]
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    Quality evaluation of Astragali Radix through chemical pattern
    recognition of fingerprint by HPLC-DAD-ELSD
    SU Bi-ru*, DENG Hui-min, MA Hong-liang, LAI Xiao-ming, HE Wen-ling, WU Chang-hai
    (Guangzhou Baiyunshan Zhongyi Pharmaceutical Company Limited, Guangzhou 510530, China)
    [Abstract] Objective: To develop an HPLC-DAD-ELSD method for detecting the fingerprint of Astragali Radix and evaluate the quality through similarity calculation and chemical pattern recognition. Method: Separation was performed at 25 ℃ on an Agilent Zorbax ODS C18 column(4.6 mm×250 mm,5 μm). Gradient elution was performed with the mobile phases of acetonitrile and water containing 0.2% formic acid. The flow rate was 0.8 mL· min-1, and sample size was 10 μL. The UV detection wavelength was set at 280 nm. The drift tube temperature for ELSD was set at 110 ℃, and the nebulizing gas flow rate was 3.0 L· min-1. The similarity calculation and chemical pattern recognition were used for fingerprint analysis. Result: The HPLC-DAD-ELSD method for chromatographic fingerprint of Astragali Radix showed better results of stability, precision and repeatability. The reference chromatographic fingerprint of Astragali Radix was established on the eighteen Astragali Radix samples from different sources. The results of similarity calculation were higher than 0.83, which was in accordance with the result of chemical pattern recognition analysis. Conclusion: Fingerprint and chemical pattern recognition analysis could effectively distinguish Astragali Radix from different source, which could be applied to the quality control of Astragali Radix.
    [Key words] Astragali Radix; fingerprint; HPLC-DAD-ELSD; chemical pattern recognition
    doi:10.4268/cjcmm20131920
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